宏基因组数据分析中，经常会使用多种多样的数据库，如综述型的有NCBI非冗余核酸或蛋白序列库(NR)、KEGG、COG、eggNOG、RFAM等。专业型的数据库有CAZy(碳水化合物酶)、ARBD(抗生素抗性基因)、CARD、VFDB、PHI等众多数据库。同时基于这些数据库，又开发了很多软件、和在线服务器(web server)方便同行使用。
今天带大家来学习一下CAZy数据库的使用。这里推荐一个今年刚发表在核酸研究(IF>11)的webserver，方便大家鼠标点点，轻松完成宏基因组碳水化合物酶组学的注释。
之前精讲过一篇Science封面文章，如下：
- 3分和30分文章差距在哪里？
正文仅有3个主图，图2的宏基因组部分就围绕着碳水化合物代谢相关基因组(CAZYome)进行的研究。今天就带大家学习一下它是如何实现。
先回顾一下Science图2的主要结果。
实例解读
本图主要基于宏基因组测序碳水化合物代谢基因的种类、丰度进行分析，揭示哈扎人菌群功能周期的变化和与现代人的差别。
本图有8个子图分为5组，从5个不同的角度/主题进行说明。
图2. 哈扎人肠道菌群功能随季节周期循环
(A) 箱线图展示宏基因组基因Shannon多样性按季节变化和与现代人比较；
(B) PCA分析CAZYome表明哈扎人与现代间此类基因显著差异即为样品间主要差异;
© 动植物碳水化合物/粘多糖占CAZYome中比例在哈扎人和现代人间存在显著差异;
(D) 几种CAZymes丰度在哈扎人中周期变化，以及与现代人比较
(E) 抗生素抗性基因多样性，哈扎人低于现代人，且存在季节周期变化
点评：宏基因组中从整体到类别，可分析的结果很多，但结果是用于服务科学问题和故事主线的。其中饮食的不同，主要影响碳水化合物的比例和组成，以及抗性基因的种类和丰度。因此选定好的逻辑出发点和故事主线是高水平文章的重点，这个别人很难帮你。但你有了好思路，找技术达人合作或与课题负责分析的朋友沟通，那是水到渠成和锦上添花的事，即使花费大量时间去美化都是值得的。当然也可自学差异箱线图绘制。
分析方法探索(顺藤摸瓜)
看完以上结果，我们会感觉工作很漂亮。但如何实现呢？这是一个大问题。我们接下来查找文章的方法。
Science文章，正常只有2-3页，大部分是结果，很少会有版面去描述方法。我们从文章主页下载的补充材料。有宏基因组分析方法描述如下：
宏基因组测序分析
使用DeconSeq去除人类基因组数据。32个HMP人作为对照同哈扎人相同方法分析。DynamicTrim对宏基因组数据质控，FragGeneScan鉴定编码基因。数据采用HUMAnN2分配至KEGG数据库。HMMER 3.0(45)使用dbCAN鉴定CAZymes(46)；使用ResFams鉴定抗生素抗性基因(47)，E-value < 1e-5。
- S. R. Eddy, A new generation of homology search tools based on probabilistic inference. Genome Inform. 23, 205–211 (2009). http://hmmer.org/
- Y. Yin, X. Mao, J. Yang, X. Chen, F. Mao, Y. Xu, dbCAN: A web resource for automated carbohydrate-active enzyme annotation. Nucleic Acids Res. 40, W445–451 (2012). http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/
- M. K. Gibson, K. J. Forsberg, G. Dantas, Improved annotation of antibiotic resistance determinants reveals microbial resistomes cluster by ecology. ISME J. 9, 207–216 (2015). http://www.dantaslab.org/resfams
我们列出了与CAZymes相关分析的方法段落，发现是使用dbCAN工具的HMMER方法鉴定的CAZymes，分别对应了引文45和46。再阅读这两篇文章，找到相关软件和数据库的主页，发现了分析CAZymes的在线服务器dbCAN2，它整合了最新的数据库和三种方法，我们可以轻松在线完成分析。
文章：https://academic.oup.com/nar/article/46/W1/W95/4996582
dbCAN2于今年5月16日在线发表于《核酸研究》杂志(IF=11.561)，它是上文Science使用的dbCAN的升级版。知道为什么出2吗？第一版2012年出表至今已经引用571次了。
dbCAN2简介
网址：http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/
dbCAN2宏基因组服务器自动化碳水化合物酶注释。相关的网站有CAZy, CAT(过时)和Hotpep。
dbCAN2的分析的主要步骤如下：
- 可提交基因组或宏基因组序列fna文件。真核基因组请使用蛋白序列faa文件
- 自动化注释分三步
- 基于dbCAN CAZyme结构域HMM数据库，HMMER注释CAZYme结构域的边界
- DIAMOND注快速释blast比对CAZy数据库
- Hotpep基于PPR文库鉴定短保守motifs
- 提交faa + gff文件，服务器使用CGC-Finder可鉴定转录因子TF、转动蛋白和CAZyme基因簇(CGCs)。
- 结果可以可视化，如维恩图多方法比较。提供比对结果表格下载。
本服务器每年更新一次CAZy数据库。
主页上有5个菜单，分别主页简介(Home)、在线注释(Annotate)、下载本地版(Download)、帮助(Help)和联系作者(about us)
详细的教程可见帮助页。
在线分析
在线分析基本原理如上图。DNA进行预测蛋白。再进行三种方法(HMM, diamond, hotpep)的预测。
点击Annotate在线注释
下图以蛋白序列为例。核酸序列，软件还会利用Prodigal自动预测蛋白。
- 填写E-mail，任务完成时获得结果链接；
- 序列类型，可选fasta核酸或蛋白序列
- 工具选择。默认只选了HMMER，一般也够用了。可以再选diamond、hotpep和CGCFinder。
- 基因位置文件gff/bed格式(可选)，蛋白则不需要；
- 序列文件，少量可粘贴，大量则上传文件，要求小于100M。
点击Submit就等着收结果吧。运行完成见如下页面。即使关闭，会收到结果页的链接。
上面维恩图，是用三种注释方法结果的比较。下面为注释结果的总结，和每种方法的结果。可以下载结果表格。也可以查看每种方法比对结果的详细。
要想查看每种CAZy酶的注释，可以点击蓝色的链接，跳转CAZy官网查看。
基于注释的结果，对我们宏基因组基因丰度矩阵进行筛选，就可以进行CAZyome的分析了。是不是挺容易的。
本地软件和数据库下载
http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/download/
有本平台所有的软件和数据库，查看README.txt
碳水化合物蛋白数据库
CAZyDB.07312018.fa 蛋白序列520Mb，可以用diamond比对
序列名为GeneBankID，和分类
AWI06117.1|GT2
CAZyDB.07312018.fam-activities.txt 分类描述文件
AA10 AA10 (formerly CBM33) proteins are copper-dependent lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs); some proteins have been shown to act on chitin, others on cellulose;
CAZyDB.07312018.pr-with-ec.txt 基因对应酶学编号
AAC00570.1 GT1|2.4.1.195
HMM数据库
dbCAN-HMMdb-V7.txt HMM模型
dbCAN2具体的本地安装涉及较多软件和数据库的布置，有时间写个专门的文章进行讲解。本文讲的在线版分析可以满足大多数同行。
- Smits, Samuel A., et al. “Seasonal cycling in the gut microbiome of the Hadza hunter-gatherers of Tanzania.” Science 357.6353 (2017): 802-806. http://science.sciencemag.org/content/357/6353/802
- 附件目录 http://science.sciencemag.org/content/suppl/2017/08/24/357.6353.802.DC1
- 补充方法 http://science.sciencemag.org/content/sci/suppl/2017/08/24/357.6353.802.DC1/aan4834_Smits_SM.pdf
- 附表1. 样品列表 http://science.sciencemag.org/highwire/filestream/698500/field_highwire_adjunct_files/1/aan4834_Table_S1.csv
- 附表3. KEGG通路表 http://science.sciencemag.org/highwire/filestream/698500/field_highwire_adjunct_files/2/aan4834_Table_S3.csv
- 附表4. KEGG Carbohydrate metabolism pathways http://science.sciencemag.org/highwire/filestream/698500/field_highwire_adjunct_files/3/aan4834_Table_S4.csv
- Zhang, Han, et al. “dbCAN2: a meta server for automated carbohydrate-active enzyme annotation.” Nucleic acids research (2018).
- http://cys.bios.niu.edu/dbCAN2/
- 10000+: 菌群分析
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